(一) 細胞培養實驗室的設置

　　組織細胞培養技術與其他一般實驗室工作的主要區別在于要求保持無菌操作，避免微生物及其他有害因素的影響.目前,超凈工作臺的廣泛使用，很大程度上方便了組織細胞培養工作，并使一些常規實驗室有可能用于進行細胞培養.

　　細胞培養實驗室應能進行六方面的工作：無菌操作、孵育、制備、清洗、消毒滅菌處理、儲藏。

　　1．無菌操作區

　　（1)無菌操作室：無菌操作區只限于細胞培養及其他無菌操作的區域，最好能與外界隔離,不能穿行或受其他干擾。

　　理想的無菌操作室應劃為三部分：

　　a）更衣室—―供更換衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。

　　b）緩沖間—―位于更衣間與操作間之間，目的是為了保證操作間的無菌環境,同時可放置恒溫培養箱及某些必需的小型儀器。

　　c)無菌操作間—―專用于無菌操作、細胞培養。其大小要適當，且其頂部不宜過高(不超過2.5m）以保證紫外線的有效滅菌效果；墻壁光滑*以便清潔和消毒.工作臺安置不應靠墻壁，臺面要光滑壓塑作表面，漆成白色或灰色以利于解剖組織及酚紅顯示pH的觀察。

　　無菌操作間的空氣消毒:

　　紫外線燈—－產生臭氧，并且室內溫度及濕度均較高，不利于工作人員健康。

　　空氣過濾的恒溫恒濕裝置—－最好。

　　表1潔凈室（區）空氣潔凈度級別表

　　潔凈度級別塵粒最大允許數／立方米微生物最大允許數浮游菌／立方米沉降菌／皿

　　100級3，500051

　　10000級350，0002，0001003

　　100000級3,500，00020,00050010

　　300000級10,350,00060,000-15

　　無臭氧紫外線消毒器

　　電子消毒滅菌器—－在高壓電場作用下，電子管的內外電極發生強烈電子轟擊，使空氣電離而將空氣中的氧轉換成臭氧。臭氧是一種強氧化劑，能同細菌的胞膜及酶蛋白氫硫基進行氧化分解反應，從而靠臭氧氣體彌漫性擴散達到殺菌之目的，消毒時沒有死角。消毒后空間的殘留臭氧只需30～40min即能自行還原成氧氣,空氣不留異味，消毒物體表面不留殘毒。

　　（2）凈化工作臺：操作簡單，安裝方便，占用空間小且凈化效果很好。一般細菌培養室使用的凈化工作臺主要有兩種：a）側流式或稱垂直式b)外流式或稱水平層流式。

　　凈化工作臺工作原理(大致相同）-－通常是將室內空氣經粗過濾器初濾，由離心風機壓入靜壓箱，再經高效空氣過濾器精濾，由此送出的潔凈氣流以一定的均勻的斷面風速通過無菌區，從而形成無塵無菌的高潔凈度工作環境。

　　側流式工作臺—－空氣凈化后的氣流由左或右側通過工作臺面流向對側，也有從上向下或從下向上流向對側，形成氣流屏障保持工作區無菌。工作臺結構為封閉式。

　　外流式(水平式)工作臺—－凈化后的空氣面向操作者流動，因而外方氣流不致混入操作，但進行有害物質實驗操作則對操作者不利。工作臺結構為開放式（已少用)。

　　凈化工作臺應用注意：

　　(1）凈化工作臺應安裝在隔離好的無菌間或清潔無塵的房間內，以免塵土過多易使過濾器阻塞,降低凈化效果，縮短其使用壽命。

　　（2）新安裝的或長期未使用的工作臺，工作前必須對工作臺和周圍環境用真空吸塵器或不產生纖維的工具進行清潔工作,然后再采用藥物滅菌法或紫外線滅菌進行滅菌處理。

　　（3）使用凈化工作臺前，應先用75％酒精擦洗臺面，并提前以紫外線滅菌燈照射30~50min處理凈化工作區內積存的微生物.關閉滅菌燈后應啟動風機使之運轉兩分鐘后再進行培養操作。

　　（4）凈化工作區內不應存放不必要的物品，以保持潔凈氣流流型不受干擾。

　　(5）注意凈化區內氣流的變化，一旦感到氣流變弱，如酒精燈火焰不動，加大電機電壓仍未見情況改變則說明濾器已被阻塞，應及時更換。一般情況下，高效過濾器三年更換一次。更換高過濾器應請專業人員操作，以保持密封良好。粗過濾器中的過濾布（無紡布）應定期清洗更換，時間應根據工作環境潔凈程度而定，通常間隔3—6個月進行一次。

　　（6）凈化工作臺使用完畢應及時清理工作臺面上的物品并用酒精擦洗臺面使之始終保持潔凈。

　　（7）凈化工作臺應定期進行功能測試，檢查凈化工作臺各項工作指標是否達到要求,例如進行無菌試驗，定期檢查臺面空氣的潔凈度是否達標.

　　超凈工作臺的無菌程度檢查超凈工作臺在消毒處理后，無菌試驗前及操作過程中需檢查空氣中菌落數；取直徑約90mm平皿，在超凈工作臺內點燃酒精燈，在酒精燈旁，以無菌操作，將平皿半開注入溶化的營養瓊脂培養基約20ml，制成平板，在30~35℃預培養48小時，證明無菌后將平板3個，以無菌方式帶入超凈工作臺內左、中、右各放一個;打開平皿蓋扣置,平板在空氣中暴露30分鐘后將平皿蓋蓋好，置30～35℃培養48小時，取出檢查，100級清潔度要求：3個平皿上生長的菌落數平均不得超過1個.

　　超凈工作臺應定期請有關部門檢查其潔凈度，應達到100級（一般用塵埃粒子計數儀）檢測塵埃粒徑≤5祄的粒數不得超過3。5個／升；空氣流量應控制在0.75~1.0m3/s;細菌菌落數平均<1個，可根據無菌狀況必要時置換過濾器。

　　2．孵育區

　　本區對無菌的要求雖不比無菌區嚴格，但仍需清潔無塵，因此也應設置在干擾少而非來往穿行的區域。孵育可在孵箱或可控制溫度的溫室中進行，后者費用高，一般實驗室多采用孵箱進行工作.

　　3．制備區

　　在該區主要進行培養液及有關培養用的液體等的制備。

　　4．儲藏區

　　主要存放各類冰箱、干燥箱、液氮罐、無菌培養液、培養瓶等，此環境也需要清潔無塵.

　　5．清洗和消毒滅菌區

　　清潔和消毒滅菌區應與其他區域分開，主要進行所有細胞培養器皿的清洗、準備、消毒及三蒸水制備等工作。

　　(二）細胞培養實驗室的設備

　　組織細胞培養室除一般實驗室的普通常規設備外，尚有一些特殊需要的設備。基本可分為兩大類：第一類為常用的基本設備;第二類為較高級的特殊設備.

　　1。常用的基本設備

　　（1)儀器：

　　a）顯微鏡：倒置顯微鏡—-是組織細胞培養室所必需的日常工作常規使用設備之一，便于掌握細胞的生長情況并觀察有無污染等。

　　——若有條件，尚可配置帶有照相系統的高質量相差顯微鏡、解剖顯微鏡、熒光顯微鏡、錄像系統或縮時電影拍攝裝置等，以便隨時觀察、記錄、攝影細胞生長情況。

　　a）培養箱：體外培養的細胞和體內細胞一樣，需要在恒定的溫度下生存，大多數情況下，最適溫度是37℃,溫差變化一般不應超過±0。5℃，細胞在溫度升高2℃時，持續數小時即不能耐受，40℃以上將很快死亡.因此需要有能控制溫度的培養箱，如具有較高靈敏度的恒溫培養箱及CO2培養箱。

　　恒溫培養箱——應選隔水式或晶體管自控溫培養箱，此類培養箱靈敏度高，溫度控制較穩定。一般的恒溫培養箱價格較便宜,其缺點是只宜于作密閉式培養。

　　CO2培養箱—-目前多數的細胞培養室已廣泛使用。CO2培養箱的優點是能夠提供進行細胞培養時所需要的一定量的CO2（常用濃度為5%)，易于使培養液的pH保持穩定,適用于開放或半開放培養。培養細胞的器皿可用培養皿、培養板或培養瓶；當使用培養瓶時,可將瓶蓋略微旋松，使培養瓶內與外界保持通氣狀態。由于這種培養方法培養器皿內部與外界相通，培養箱內空氣必須保持清潔，應定期以紫外線照射或酒精消毒。同時培養箱應放置盛有無菌蒸餾水的水槽，防止培養液蒸發,使箱內相對濕度始終保持為100％。

　　c）干燥箱：用于細胞培養箱的有些器械、器皿需要烘干后才能使用,玻璃器皿等須干熱消毒.干熱消毒時，電熱干燥箱升溫較高，一般需達到160℃以上。通常使用鼓風式電熱干燥箱。其優點是溫度均勻、效果較好，缺點是升溫過程較慢。升溫時不能先升溫后鼓風而應鼓風與升溫同時開始，至100℃時，停止鼓風，應避免包裹器皿的紙或棉花燒焦，燒焦的碎屑可影響細胞的生長。消毒后,不能立即打開箱門以免驟冷而導致玻璃器皿損壞，應等候溫度自然下降至100℃以下方可開門。

　　d）水純化裝置：細胞培養對水的質量要求較高，細胞培養以及與細胞培養工作相關的液體的配制用水必須事先嚴格純化處理。水純化時可采用離子交換裝置或蒸餾器。離子交換純水尚不能有效去除有機物，因此用水時尚需再次蒸餾。進行細胞培養時配制各種培養液及試劑等均需使用三次蒸餾水:即使是用于玻璃器皿的沖洗，也應使用二次以上蒸餾水.

　　目前國內使用較多的是自動雙重純水蒸餾器（石英管加熱）,使用方便，安全、蒸餾速度快（1600ml/h）。

　　使用注意：

　　○a不可采用普通自來水蒸餾，以免蒸餾器內很快結成水垢影響蒸餾效果;同時,還需視蒸餾器內存水垢程度定期*清洗蒸餾器.

　　○b正確的使用方法是將經金屬蒸餾器蒸餾的蒸餾水加入玻璃蒸餾器內進行再次蒸餾。

　　一般配制培養液的用水應在配液前蒸餾，不宜使用存放數日的三蒸水，以免影響培養用水的質量.

　　目前市場上供應的是含有各種級別和類型的采用一種或多種純化方法相結合的使普通水純化為純水和超純水的純水系統可供選擇。例如：設計靈活的可以掛壁、也可為臺式，也可以有儲水箱、也可直接用分液槍的純水裝置；還可根據各類實驗用水需求選擇配備有效殺菌或去除DNA酶、RNA酶、蛋白酶等，甚至可有效去除掉熱源、內毒素的超濾型純水器。

　　e）冰箱：細胞培養室必須配備

　　○a普通冰箱或冷藏柜

　　—-儲存培養液、生理鹽水、Hank’s液試劑等培養用的物品及短期保存組織標本。

　　○b低溫冰箱（—20℃）、超低溫冰箱

　　—-用于儲存需要冷凍保存生物活性及較長時期存放的制劑,如酶、血清等。

　　——細胞培養室的冰箱應屬專用，不得存放易揮發、易燃燒等對細胞有害的物質，且應保持清潔。

　　f）細胞冷凍儲存器：儲存器常用的是液氮容器。根據使用需要分為不同的類型及多種規格。選擇購置液氮容器時要綜合考慮容積大小,取放使用方便及液氮揮發量（經濟）三種因素.液氮容器的大小可自25L～500L，可以儲存1ml的安瓿250～15000個左右。液氮溫度可低達-196℃，使用時應防止凍傷。由于液氮不斷揮發，應注意觀察存留液氮情況，及時定期補充液氮，避免揮發過多而致細胞受損。

　　目前，國內各類實驗室已廣泛使用新型的細胞冷凍儲存器。市場所提供的各種新型的細胞冷凍儲存器具有性能優異，使用方便等特點.例如：

　　——可通過*電子控制器實現凍存自動化并監測液氮水平和樣品溫度，確保樣品溫度始終處于設定溫度點；

　　-—可配備*報警系統,分別警報液氮液面、溫度、電池、電壓、電源等失常情況：

　　——同時具備熱氣體旁路系統,防止高于-130℃的暖空氣進入液氮罐，從而更有效地保護樣品,防止升溫.

　　另外,多種規格的*液氮運輸，供應罐系列不僅移動方便,還可通過連接管給儲存罐補充液氮，提高工作效率，保證樣品安全。

　　g）離心機：進行細胞培養時，常規需要進行制備細胞懸液、調整細胞密度、洗滌、收集細胞等工作，通常需要使用離心機.

　　○a一般可常規配置4000rpm的國產臺式離心機，例如細胞沉降，使用80～100g的離心機即可，離心力過大有時可能引起細胞的損傷。

　　○b另外，可根據需要添置其他類型如大容量或可調節溫度的離心機等

　　○c若需特殊用途,例如某些細胞的分離制備需梯度離心，則需另行配置實驗所需的具備其他特殊功能的離心機。

　　h）天平：常用的有扭力天平、精密天平及各種電子天平。

　　分析天平的感量為0。1mg、0。01mg和0.001mg。根據稱取物質的量和稱量精度的要求，選擇適宜級別的天平。要求精密稱定時，當取樣量大于100mg選用感量為0.1mg天平，在100－10mg選用感量為0.01mg天平，小于10mg選用感量為0。001mg天平。

　　i）消毒器:直接或間接與細胞接觸的物品均需消毒滅菌處理。

　　常用:○a手提式高壓蒸汽消毒器

　　○b目前市場上，具有高效、安全、方便等性能,適用于各種器皿、液體、培養基的高壓滅菌裝置已在流通（如脈動真空滅菌器）。可供使用者在滅菌的同時監測滅菌容器內的壓力和溫度，確保滅菌質量和安全,并可通過記憶（儲存)支持系統改變各種參數（例如滅菌、排氣、加熱等參數），即使在進行滅菌時發生停電故障，仍可保留所設定的參數

　　j）濾器:目前細胞培養工作中采用的培養用液，包括人工合成培養液、血清、消化用胰酶等常含有維生素、蛋白、多肽、生長因子等物質，這些物質在高溫或射線照射下易發生變性或失去功能，因而上述液體多采用濾過消毒以除去細菌。

　　目前常使用的濾器有Zeiss濾器、玻璃濾器和微孔濾器,各種濾器有其使用原理和特點（后詳述).

　　(2）培養用器皿：

　　a）培養器皿：供細胞接種、生長等用的器皿,可由透明度好、無毒的中性硬質玻璃或無毒而透明光滑的特制塑料制成。

　　（a）玻璃培養器皿的優點是多數細胞均可生長，易于清洗、消毒，可反復使用,并且透明而便于觀察;缺點是易碎,清洗時費人力。

　　(b）塑料制培養器皿的優點是一次性使用，廠家已消毒滅菌密封包裝，打開即可用于細胞培養操作。

　　常用的培養器皿：

　　培養瓶：由玻璃或塑料制成。主要用于培養、繁殖細胞。進行培養時培養瓶瓶口加蓋螺旋瓶蓋或膠塞，膠塞多用于密封培養。國產培養瓶的規格以容量（ml)表示，如250ml、100ml、25ml等；進口培養瓶則多以底面積(cm2）表示。

　　培養皿:由玻璃或塑料制成，供盛取、分離、處理組織或做細胞毒性、集落形成、單細胞分離、同位素摻入、細胞繁殖等實驗使用.常用的培養皿規格有10cm、9cm、6cm、3.5cm等.

　　多孔培養板：為塑料制品。可供細胞克隆及細胞毒性等各種檢測實驗使用。其優點是節約樣本及試劑，可同時測試大量樣本，易于進行無菌操作。培養板分為各種規格，常用的規格有：96孔、24孔、12孔、6孔、4孔等。

　　各種單層生長的細胞在培養器皿中長滿時可獲得的細胞數,主要是取決于器皿的底表面積和細胞體積的大小。常用培養器皿及可獲得的細胞數（以Hela細胞為例）見表2.

　　表2常用的培養器皿及可獲得的細胞數

　　培養器皿底面(cm2）加培養液量（ml)可獲細胞量

　　96孔培養板0.320.11×105

　　24孔培養板21。05×105

　　12孔培養板4。52.01×106

　　6孔培養板9.62。52。5×106

　　4孔培養板285。07×106

　　3.5cm培養皿83.02.0×106

　　6cm培養皿215。05.2×106

　　9cm培養皿4910.012.2×106

　　10cm培養皿5510。013。7×106

　　25cm塑料培養瓶255.05×106

　　75cm塑料培養瓶7515～302×107

　　25ml玻璃培養瓶194。03×106

　　100ml玻璃培養瓶37.510。06×106

　　250ml玻璃培養瓶7815。07×107

　　2500ml旋轉培養瓶700100～2502。0×108

　　b）培養操作有關的器皿：

　　○a貯液瓶：主要用于存放或配制各種培養用液體如培養液、血清及試劑等。貯液瓶分為各種不同規格，如1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml、5ml等。

　　○b吸管：主要分為刻度吸管、無刻度吸管。刻度吸管主要用于吸取、轉移液體，常用的有1ml、2ml、5ml、10ml等規格。無刻度吸管分為直頭吸管及彎頭吸管，除可以作吸取、轉移液體外，彎頭尖吸管還常用于吹打、混勻及傳代細胞。

　　○c加樣器（移液器）：用于吸取、移動液體或滴加樣本。可根據需要調節量的大小，吸量準確、方便。尤以微量加樣器,可保證實驗樣品(或試劑）含量精確,重復性良好。目前，可高溫消毒的，多通道的各類移液器可供使用者選擇,能確保加樣準確、快速、方便并且達到無菌要求.

　　c）其他用品：尚有收集細胞用的離心管，放置試劑或臨時插置吸管用的試管，裝放吸管以便消毒的玻璃或不銹鋼容器,用于存放小件培養物品便于高壓消毒的鋁制飯盒或貯槽,套于吸管頂部的橡膠吸頭，封閉各種瓶、管的膠塞、蓋子、凍存細胞用的安瓿或凍存管、不同規格的注射器、燒杯和量筒以及漏斗，超凈工作臺使用的酒精燈，供實驗人員操作前清潔消毒手使用的盛有酒精或其他消毒液的微型噴壺等。

　　(3)器械:主要用于解剖、取材、剪切組織及操作時持取物件。常用的有：手術刀或解剖刀、手術剪或解剖剪（彎剪及直剪），用于解剖動物、分離及切剪組織,制備原代培養的材料；眼科虹膜小剪(彎剪或直剪），用于將組織材料剪成小塊;血管鉗及組織鑷、眼科鑷(彎、直），用于持取無菌物品（如小蓋玻片）夾持組織等；口腔科探針或代用品,用以放置原代培養之組織小塊。

　　2、特殊設備

　　細胞培養實驗室除了應配備上述的常用基本設備以外，如有條件,可添置一些特殊或*設備儀器,以便更有效、更精確、更深入地進行實驗室工作。例如：

　　（1）酶聯免疫檢測儀—-可用于進行免疫學測定及細胞毒性、藥物敏感性檢測等。

　　（2）超低溫冰箱（-85℃）——便于儲存某些試劑及標本。

　　(3）旋轉培養器——用于某些特殊細胞或需要收獲大量細胞的培養。

　　（4）熒光顯微鏡——進行熒光染色樣本的觀察。

　　（5）流式細胞儀-—可更精確及快速檢測細胞。

　　（6)用于檢測細胞培養條件的各種儀器,例如專門為快速分析細胞培養基中主要或關鍵營養成分、代謝產物及氣體含量設計的多功能細胞培養分析儀、手提式CO2濃度測定儀等。